體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 620和 LOVO ,加入終濃度分別為 20 ～100μmol/L 的人參皂苷 Rh2。采用 MTT法測定藥物對細(xì)胞的的增殖抑制率 ( IR ) ,并計(jì)算半數(shù)抑制濃度 ( IC50) 。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果:人參皂苷 Rh2作用 SW 620和 LOVO  24 小時(shí) IC50分別為 36μmol/ l和 40μmol/L;

　　人結(jié)腸癌細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)方法

　　1.3.  1　細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 　收集對數(shù)生長期的SW 620和 LOVO 細(xì)胞 , 以 1  ×105 /L 密度接種于 96孔培養(yǎng)板中,每孔 100μl,待細(xì)胞貼壁后加入終濃度為 20、30、40、50、60、70、80、100 mol的 Rh2,每個(gè)濃度設(shè)平行孔 4個(gè) ,于37℃, 5% CO培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 24、48和72小時(shí),每孔加入  5mg/mL的MTT20  L ,繼續(xù)培養(yǎng) 4 小時(shí)后 , 離心棄上清 ,加入150 L DM SO溶解 ,酶標(biāo)儀 490nm 處檢測 OD 值 ,計(jì)算藥物的體外生長抑制率 ( IR )  IR  =  ( 1 - 給藥孔平均值 /對照孔平均值) 所對應(yīng)的藥物濃度 (IC50  ) 。×100% ,計(jì)算 50%抑制率時(shí)所對應(yīng)的藥物濃度 (IC50  ) 。

　　1. 3. 2　人結(jié)腸癌細(xì)胞株細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察　上述細(xì)胞在加入 MTT之前 ,倒置顯微鏡照相 ,記錄細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

　　1. 4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 　采用 SPSS13.  0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 ,所有數(shù)據(jù)用  x ±s  表示,采用 t檢驗(yàn)

　　2  人結(jié)腸癌細(xì)胞株結(jié)果

　　2.  1　人參皂苷 Rh2 對人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW 620 和LOVO 生長的抑制作用　不同濃度 Rh2作用于細(xì)胞后不同時(shí)間,細(xì)胞毒作用呈明顯的時(shí)間和劑量依賴性, 見圖 1 ～5。Rh2 對SW 620細(xì)胞的IC50為36μmol/L ,而對 LOVO細(xì)胞的IC50為40μmol/L作用時(shí)間均為 24小時(shí)。

　　2. 2　細(xì)胞形態(tài)觀察　加藥組細(xì)胞體積變小、變形出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落現(xiàn)象,細(xì)胞核固縮凝塊,見圖 6～7。

　　顯微鏡觀察人結(jié)腸癌細(xì)胞株 ,藥物作用后細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)。結(jié)論:人參皂苷 Rh2對 SW 620和 LOVO 細(xì)胞的生長具有抑制作用 ,且呈時(shí)間劑量依賴性。

　　腸癌是人類高發(fā)的消化系統(tǒng)惡性疾病 ,在惡性腫瘤發(fā)病率中排第 4 位 ,轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是大腸癌患者死亡的主要原因之一。目前臨床以手術(shù)治療并輔以術(shù)后放、化療為主要治療手段 ,但對晚期腸癌效果并不顯著。人參皂苷是從中藥人參中提取的具有抗癌作用的主要活性成分 , 以往的人結(jié)腸癌細(xì)胞株研究表明其能誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。國內(nèi)外文獻(xiàn)先后報(bào)道人參皂苷 Rh2 對多種腫瘤細(xì)胞如人肝癌細(xì)胞SK2HEP21、乳腺癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞 HL60等具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)旨在研究人參皂苷 Rh2 對人人結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖的抑制作用。

　　人參皂苷 Rh2 作為抗腫瘤作用非常顯著的中藥單體 ,可以通過降低細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度抑制 PKC α的轉(zhuǎn)位和激活 , 進(jìn)一步抑制細(xì)胞 內(nèi)PKCα蛋白的表達(dá) ,zui終阻礙 PKCα介導(dǎo)的增殖信號傳導(dǎo)過程      ,抑制腫瘤細(xì)胞增殖 , 同時(shí)抑制端粒酶活性 ,使腫瘤細(xì)胞的端粒長度不能維持而進(jìn)入衰老并zui終死亡[2 ]  。Rh2可通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[ 3 ] ,且其作用后使 DNA 含量較多的 S期細(xì)胞數(shù)量減少 , 而 DNA 含量較少的 G1 期細(xì)胞數(shù)量增多[4 ] ,進(jìn)一步發(fā)揮阻滯細(xì)胞周期的作用。同時(shí) Rh2是特異性抑制 Pgp 功能的逆轉(zhuǎn)劑[ 5 ],一定程度提高腫瘤對多種化療藥物的敏感性 ,減少化療藥物的臨床用藥劑量和毒副作用[ 6, 7 ]  。我們研究發(fā)現(xiàn) ,人參皂苷 Rh2單體對人結(jié)腸癌細(xì)胞株株 SW 062 和 LOVO 的生長有抑制作用 ,且與時(shí)間和濃度呈依賴性。同時(shí), 還發(fā)現(xiàn) Rh2有體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用 ,顯微鏡下觀察細(xì)胞出現(xiàn)濃縮、變圓、脫落等細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變。本研究結(jié)果表明,人參皂苷 Rh2單體有抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖和誘導(dǎo)其凋亡的作用 ,有潛在治療結(jié)腸癌的應(yīng)用價(jià)值 ,但其具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

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